logo
  • ru
  • Позвоните нам
    +7 (812) 401-99-01
  • E-mail
    info@cvo.su

Набор для выявления вируса лейкоза птиц (ВЛП) методом иммуноферментным анализом (ИФА)

В состав набора входят иммуноспецифические и химические компоненты:

  • полистироловые 96-луночные микропанели с адсорбированными в лунках кроличьими антителами к р27 ВЛП — 2 микропанели;
  • буфер для разведения испытуемых и контрольных проб;
  • промывочный буфер;
  • стандарт (жидкость с повышенным содержанием антигена ВЛП);
  • положительный контроль (жидкость, содержащая антиген ВЛП);
  • отрицательный контроль — (жидкость, не содержащая антиген ВЛП);
  • антивидовой конъюгат (IgG-антитела к р27 ВЛП, меченые щелочной фосфатазой);
  • субстрат;
  • стоп-раствор.

Набор рассчитан на анализ 88 испытуемых проб на каждой микропанели. Компоновка набора допускает возможность дробного использования компонентов для проведения нескольких исследований по мере поступления биологического материала.

Для исследования используют индивидуальные сыворотки крови птиц без признаков гемолиза и бактериальной контаминации объемом 0,3-0,5 см3и/или пробы белка яиц объемом не менее 0,2 см3..

Следует помнить, что ИФА является высокочувствительным методом, поэтому ошибки, связанные с подготовкой образцов, проведением инкубационного, температурного и промывочного режимов могут быть причиной получения недостоверных результатов.

Перед началом работы микропанели и все компоненты набора выдерживают 20-30 мин при температуре 22-27°С. Не использованные реагенты убирают в холодильник (2 — 8°С) сразу же после проведения исследования.

Антитела к р27 ВЛП, адсорбированные в лунках полистироловой микропанели, связываются с р27 антигеном ВЛП, присутствующим в исследуемом материале, в результате чего формируется комплекс антиген-антитело. Полученный иммунный комплекс выявляется после взаимодействия с конъюгатом (IgG-антитела к р27 ВЛП, меченые щелочной фосфатазой), фермент которого после добавления субстрата вызывает разложение субстрат — индикаторного раствора и образование окрашенного продукта. При этом интенсивность окраски в лунке микропанели пропорциональна содержанию вируса в исследуемом материале.

Приготовление рабочих растворов

Буфер для разведения проб. Концентрированный раствор буфера разводят в 4 раза дистиллированной или деионизованной водой. Промывочный буфер. Концентрированный раствор буфера разводят в 20 раз дистиллированной или деионизованной водой. Коньюгат, субстратный раствор и стоп-раствор — готовы к употреблению.

Подготовка испытуемых сывороток и контрольных проб

Все испытуемые сыворотки, стандарт, положительный и отрицательный контроли разводят в соотношении 1:2 буфером для разведения проб, используя для каждого образца новый наконечник.

Постановка реакции

В лунки микропанели в двух повторах вносят по 100 мкл приготовленных контрольных проб: буфер для разведения проб, отрицательный контроль, положительный контроль, стандарт.

В остальные лунки микропанели вносят по 100 мкл приготовленных в разведении 1:2 испытуемых проб сыворотки крови и инкубируют 30 мин при температуре 20-30°С. После инкубации лунки освобождают от содержимого резким встряхиванием и трижды промывают промывочным буфером (по 300 мкл в каждую лунку), каждый раз выдерживая лунки с буфером не менее 30 сек. При этом не рекомендуется оставлять лунки сухими в промежутках между промывками. Затем жидкость окончательно удаляют, микропанель подсушивают постукиванием по сложенной в несколько слоев фильтровальной бумаге.

Затем в лунки микропанели вносят по 100 мкл конъюгата и выдерживают 30 мин при температуре 20-30°С. После инкубации проводят процедуру промывания лунок. Далее в используемые лунки микропанели вносят по 100 мкл субстрата и выдерживают 30 мин при температуре 20-30°С. После чего реакцию останавливают, добавляя в каждую используемую лунку по 100 мкл стоп-раствора. Сразу же после остановки реакции проводят измерение оптической плотности (О.П.) раствора в каждой лунке на спектрофотометре (ридер) с вертикальным лучом света при длине волны 405 нм и осуществляют оценку и интерпретацию результатов реакции.

Срок годности компонентов набора — 12 месяцев от даты изготовления при хранении их в защищенном от света месте при температуре от 2 до 8°С.